Feroptoza i njen klinički značaj

Uvod: Feroptoza, koju su prvi put spomenuli Dikson i saradnici, 2012. godine, jeste put ćelijske smrti zavisan od gvožđa, uz neophodno prisustvo lipidnih peroksida. Mehanizam procesa i signalni putevi koji u njemu učestvuju se razlikuju u odnosu na ranije poznatu apoptozu, nekrozu i autofagiju. Dolazi i do zapaljenske reakcije, što ovaj put ćelijske smrti dodatno razlikuje od apoptotskog puta. Ferostatin dovodi do inhibicije ovog procesa.

Metode: Urađen je pregled literature dobijene pretraživanjem Medline baze podataka sa posebnim osvrtom na radove koji su se bavili značajem feroptoze u kliničkoj medicini, prvenstveno hematologiji.

Rezultati: Metabolizam gvožđa u malignoj i zdravoj ćeliji se razlikuje. Maligne ćelije dobro tolerišu oksidativni stres i izbegavaju feroptozu. Po literaturnim podacima, različiti ispitivani agensi stimulišu feroptozu i time postaju mogući terapijski agensi. Neki geni povezani sa metabolizmom gvožđa pokazali su prognostički značaj kod obolelih od difuznog B krupnoćelijskog limfoma.

Zaključak: Otkrivanje novih mehanizama ćelijske smrti i signalnih puteva koji su u taj proces uključeni dovodi do potencijalno nove ciljne terapije. Iako obećavaju, ovi rezultati zahtevaju validaciju kroz dalja istraživanja.

UVOD

Feroptoza, prvi put pomenuta u radu Diksona i saradnika, 2012. godine, jeste neapoptotski, nenekrozni i neautofagni put ćelijske smrti [1]. Dolma i saradnici su, 2003. godine, otkrili da erastin može da izazove nov način ćelijske smrti, a potom su Jagoda i Jang objavili da helatori gvožđa inhibiraju ovaj proces u čijoj osnovi se nalazi disfunkcija mitohondrija [2],[3],[4].

Kao što i naziv sugeriše, feroptoza zavisi od gvožđa, dešava se u prisustvu lipidnih peroksida, a ferostatin je inhibira. Za razliku od apoptoze, u ovom procesu dolazi do privlačenja inflamatornih ćelija i reakcije zapaljenja. U procesu apoptoze, ćelijska membrana bubri i dolazi do kondenzacije hromozoma. U feroptozi se mitohondrije smanjuju, njihove membrane su hiperdenznije a mitohondrijalne kriste su manje ili ih nema [1],[5],[6],[7],[8],[9]. Biohemijski posmatrano, koncentracija glutationa u ćeliji je manja. Glutation peroksidaza 4 (engl. glutathione peroxidase – GPX4) je enzim koji dovodi do redukcije lipidnih peroksida, a čija aktivnost je u ovom procesu takođe smanjena. Jon Fe²+ oksidiše lipide, koncentracija reaktivnih kiseoničnih radikala (engl. reactive oxygen species – ROS) raste i pokreće se feroptoza [5]. U ovom putu su važni i transmembranski kanali u ćelijskim membranama kroz koje se vrši razmena cistina i glutamata. Cistin ulazi u ćeliju i u njoj se redukuje u cistein, neophodan u sintezi glutationa [1],[5]. Ovo je i mesto na kojem deluju induktori feroptoze. Helatori gvožđa inhibiraju ovaj proces, ali i ferostatin 1 (Fer-1), vitamin E i liprokstatin 1.

Feroptoza zavisi od gvožđa, te je očekivano da faktori koji učestvuju u metabolizmu gvožđa ili u regulaciji njegovog metabolizma imaju ili već dokazanu ili moguću ulogu u regulaciji ovog puta ćelijske smrti, čineći ćeliju manje ili više osetljivom na feroptozu [6],[10],[11].

Metabolizam gvožđa u zdravoj i malignoj ćeliji

Kada govorimo o regulaciji metabolizma gvožđa reč je o kontroli na ćelijskom nivou i sistemskoj regulaciji metabolizma gvožđa. Homeostaza gvožđa u ćeliji se reguliše uglavnom posttranskripcionom kontrolom gena putem interakcije elemenata i belančevina senzitivnih na koncentraciju gvožđa (engl. iron-responsive elements – IRE; iron-responsive proteins – IRP) [12].

Sistemska homeostaza je kontrolisana hepcidinom, jetrenom belančevinom čija se koncentracija, između ostalog, povećava u inflamaciji, pod dejstvom interleukina-6 i dovodi do internalizacije i degradacije feroportina. Feroportin je, po podacima iz dostupne literature u ovom momentu, jedini eksporter gvožđa iz ćelija [12].

Hranom uneseno gvožđe izlazi iz enterocita putem feroportina, u trovalentnom obliku, i vezan za transferin se prenosi do tkiva. Kompleks gvožđe-transferin se vezuje za transferinski receptor 1 (TfR1) i procesom endocitoze ulazi u ćelije. U ćeliji prelazi iz trovalentnog u dvovalentni oblik i ugrađuje se u različite enzime, ulazi u sastav hema, učestvuje u oksidativnoj fosforilaciji i sintezi dezoksiribonukleotida. Suvišno gvožđe se skladišti u feritinu.

Pokazalo se da dve belančevine – ZIP 8 i ZIP 14, s poznatom ulogom u prenošenju cinka, učestvuju i u transportu gvožđa koje nije vezano za transferin (engl. non-transferrin-bound iron – NTBI) kroz ćelijsku membranu [12-16], a imaju značaja i u hemohromatozi [16]. Njihovo mesto u drugim stanjima s nakupljanjem gvožđa, poput maligniteta i nekih anemija, ostaje nejasno [12]. Proteini PCBP1 i PCBP2 (engl. poly(rC) binding protein 1; poly(rC) binding protein 2) su šaperoni (engl. chaperones) – oni prate dvovalentno gvožđe u citoplazmi i imaju ulogu u njegovoj distribuciji u ćeliji [12],[17],[18], dok koaktivator jedarnog receptora 4 (engl. nuclear receptor coactivator 4 – NCOA4) učestvuje u autofagiji feritina, te tako deluje na iskoristivost gvožđa koje je u njemu uskladišteno [12],[19],[20],[21],[22].

Gvožđe koje se nalazi u ćeliji deponovano u feritinu je netoksično ali je, dok je na taj način vezano, nedostupno za ćelijske potrebe. Da bi bilo iskoristivo, mora se osloboditi, obično degradacijom u lizozomima [19],[20],[21],[22]. Izgleda da je način degradacije feritina isti i u stanjima s nakupljanjem gvožđa, a i kad postoji njegov nedostatak, ali se lizozomima isporučuje na drukčiji način [12],[20]. Kad postoji deficit gvožđa, dolazi do autofagije, a kad postoji nakupljanje gvožđa, aktivni su drugi putevi [20]. NCOA4 je bitan činilac u autofagiji feritina kod nedostatka gvožđa i za regulaciju homeostaze gvožđa u slezini [23],[24]. Ako nema nedostatka gvožđa, neautofagni putevi razgradnje feritina su manje aktivni u malignim ćelijama nego u zdravim, te su zato i maligne ćelije otpornije na oštećenja koje izaziva višak gvožđa [20]. Reaktivacija tih puteva bi mogla povećati toksičnost gvožđa za neoplastičnu ćeliju i možda biti nova terapijska strategija [12].

Ćelije kancera menjanju metabolizam tiola, koji su intraćelijski redoks puferi, a oksidativni stres zbog viška gvožđa povezan je sa karcinogenezom [25]. Već smo spomenuli da maligne ćelije zadržavaju veću količinu gvožđa, u lizozomima, ali i u citoplazmi i mitohondrijama. To dovodi do poremećaja njihove funkcije, preuzima se više glukoze i u prisustvu kiseonika, u procesu aerobne glikolize, produkuju se laktati. Ovaj fenomen je poznat kao Varburgov efekat. Osobina većeg preuzimanja glukoze od strane malignih ćelija koristi se u primeni pozitronske emisione tomografije (PET) u dijagnostici i proceni terapijskog efekta kod bolesnika sa malignim oboljenjima [26].

Agensi koji utiču na feroptozu

Iz svega prethodno navedenog, vidi se da maligna ćelija, bez obzira na stalnu izloženost oksidativnom stresu, ima sposobnost da ga toleriše i izbegne feroptozu [25]. Erastin i sulfasalazin blokiraju ulazak cistina kroz kanale u fosfolipidnom delu ćelijske membrane. Na taj način, kao i drugi agensi koji utiču na smanjenje produkcije glutationa u eksperimentalnim uslovima, dovode do supresije tumorskog rasta i feroptoze [25],[27],[28],[29]. Testiranja su pokazala da promena metabolizma cistina i glutationa dovodi do povišene koncentracije slobodnih kiseoničnih radikala, a antioksidativna terapija prevenira ćelijsku smrt [10]. Erastin je jak induktor feroptoze koji inhibira transmembranske antiportere za razmenu intraćelijskog glutamata i ekstraćelijskog cistina. Glutation učestvuje u održavanju redoks ravnoteže i, kad ga nema u dovoljnoj koncentraciji, nagomilavaju se slobodni kiseonični radikali, a već je rečeno da je za njegovu sintezu neophodan ulazak cistina u ćeliju [30],[31],[32]. Dikson i saradnici navode da sulfasalazin i sorafenib blokiraju ovaj antiporter i dovode do selektivne feroptoze, s tim da je, u ovoj studiji, erastin 2.500 puta snažnije inhibirao ovaj sistem od sulfasalazina. Dodatni pokazatelj značaja gvožđa u feroptozi je i to što deferoksamin, koji je helator gvožđa, suprimira ćelijsku smrt indukovanu erastinom, dok je dodatni unos gvožđa potencira [1],[27],[33]. Ispitivanja na kulturi ćelija difuznog B krupnoćelijskog limfoma su pokazala značajnu osetljivost na ćelijsku smrt indukovanu erastinom [34]. U drugom istraživanju je pokazano da erastin povećava senzitivnost leukemijskih ćelija akutne limfocitne leukemije (ALL) na efekat SMAC mimetika LCL-161 (engl. second mitochondria-derived activator of caspases – SMAC mimetic LCL-161) i da sinergističkim delovanjem dolazi do smrti leukemijske ćelije [35]. Drugi autori navode dozno zavisan efekat erastina na ćelije akutne mijeloidne leukemije, jer je u njihovim istraživanjima na kulturi ćelija dovodio do supresije njihovog rasta, ali i mešanog tipa ćelijske smrti. Supresija ovog efekta se ostvarila ferostatinom 1, inhibitorom feroptoze ili nekrostatinom 1, inhibitorom nekroptoze, ali ne i inhibitorom kaspaznog puta, koji deluje na apoptozu, niti hlorohinom, koji inhibiše autofagiju. Na kulturi ćelija hronične mijeloidne leukemije, akutne T limfoblastne leukemije i akutne promijelocitne leukemije, ovi efekti nisu postignuti. Ćelije akutne mijeloidne leukemije (AML) su, uz male doze erastina, bile značajno osetljivije na citozin arabinozid i antracikline [36], uz napomenu da je upotrebljen doksorubicin, a ne daunoblastin. U nedavno objavljenom radu, druga grupa autora je na in vitro modelu pokazala erastinom povećanu senzitivnost ćelija akutne mijeloidne leukemije na venetoklaks [37]. Fibroblasti i dendritske ćelije stvaraju cistin od kojeg zavise limfoidne ćelije, jer moraju da ga unesu da bi sintetisale cistein. Pokazano je da sulfasalazin, delujući na sistem kanala kroz koji se cistin transportuje u kulturi limfomskih ćelija, dovodi do prekida njihove proliferacije, a kasnije je na životinjskom modelu sa transplantiranim limfomom potvrđena supresija tumorskog rasta; za organizam domaćina nije bilo veće štetnosti [38]. Indukcija feroptoze je postignuta na kulturi ćelija 60 tumorskih linija delovanjem derivata artemisinina. Geni odgovorni za kodiranje belančevina koje učestvuju u metabolizmu gvožđa, poput transferina, transferinskih receptora 1 i 2, označeni su kao prediktori osetljivosti na artemisinin [39].

Feroptoza u krupnoćelijskom B limfomu

Krupnoćelijski B limfom (engl. large B-cell lymphoma – LBCL) čini oko trećinu svih ne-Hočkinovih limfoma, što znači da predstavlja najčešću limfoproliferativnu neoplazmu kod odraslih pacijenata [40]. Prvom terapijskom linijom, odnosno imunohemioterapijom po R-CHOP (rituksimab-ciklofosfamid, doksorubicin, vinkristin, prednizolon) protokolu, kompletna remisija se postiže u oko 60% bolesnika, ali lečenje pacijenata sa rezistentnom ili relapsirajućom (R/R) bolešću je i dalje klinički problem. Nisu svi bolesnici sa R/R LBCL podobni za autolognu transplantaciju matičnih ćelija, niti je CAR T ćelijska terapija (engl. chimeric antigen receptors (CAR) T-cell therapy) široko dostupna. Bispecifična antitela, u kombinaciji s drugim lekovima, uglavnom su dostupna kroz kliničke studije, a često se desi da bolesnici sa R/R bolešću ne ispunjavaju kriterijume za uključivanje u studiju ili su studije nedostupne. Široko primenjivani standardni skorovi rizika su prognostički alati kreirani da procene šansu za preživljavanje pre i u eri lečenja rituksimabom [41],[42]. Uz to, LBCL je heterogena bolest koja je i u novoj klasifikaciji Svetske zdravstvene organizacije (SZO) predstavljena sa više entiteta [43], gde u tumačenjima nekad postoje preklapanja i različito viđenje izazova, iz ugla patologa i kliničara [44]. Postoji potreba za razvojem novih prognostičkih skorova, ali i terapeutika koji bi delovali drugim mehanizmima.

Gvožđe je neophodno za mnoge procese, uključujući i ćelijsku proliferaciju [45],[46]. Devin i saradnici su razvili novi skor, IS (engl. iron score) zasnovan na profilu ekspresije gena odgovornih za metabolizam gvožđa. U dve nezavisne kohorte pacijenata sa LBCL, koje su obuhvatile 233 i 181 ispitanika, 11 gena je pokazalo prognostički značaj. Visoka ekspresija osam gena je definisala grupu sa lošom prognozom. IS je dodatno validiran u tri kohorte u odnosu na ukupno preživljavanje (engl. overall survival – OS) [47]. IS je bio značajno viši u grupi LBCL porekla aktivisanih B limfocita (engl. activated B-cell – ABC) u odnosu na one porekla germinativnog centra (engl. germinal-center B-cell-like – GCB) [47]. Isti autori su na ćelijskim linijama LBCL, odvojeno ABC i GCB tipa, testirali efekat helatora gvožđa, deferasiroksa i deferoksamina, na vijabilnost limfomskih ćelija i videli, u zavisnosti od koncentracije, smanjenu vijabilnost ćelija nakon tretmana helatorima gvožđa. U istom radu je testiran i terapijski efekat irinomicina i ustanovljeno da u nanomolarnim koncentracijama inhibira rast tumorskih ćelija. Suplementacija gvožđem je inhibirala efekat helatora na limfomske ćelije, ali ne i efekat irinomicina, što je sugerisalo drukčiji mehanizam dejstva. Naime, helatori gvožđa su dovodili do apoptoze limfomskih ćelija a irinomicin je dovodio do sekvestracije gvožđa u lizozomima, deplecije gvožđa u ćelijskom citosolu i degradacije feroportina autofagijom u lizozomima, te produkcije reaktivnih kiseoničnih radikala koji su vodili ka feroptozi [47].

Šmit i saradnici, u radu objavljenom 2021. godine, pokazuju da dimetilfumarat, lek odobren u terapiji multiple skleroze i psorijaze, izazivajući feroptozu i slabeći NF-kB/STAT 3 signalni put deluje na LBCL ćelije i ABC i GCB tipa [48].

Grupa naučnika iz Kine je, pre godinu dana, objavila da je povišen nivo glutamina povezan sa lošijim ishodom kod obolelih od LBCL, a da je koncentracija derivata glutamina, αketo-glutarata, obrnuto korelirala sa agresivnošću LBCL [49]. Akumulacija αketo-glutarata je dovodila do oksidativnog stresa u dabl hit limfomu (engl. double-hit lymphoma – DHT). Visok nivo slobodnih kiseoničnih radikala izazivao je akumulaciju lipidnih peroksida, došlo je do aktivacije TP53 i feroptoze [49].

ZAKLJUČAK

Sve je više radova koji se bave feroptozom u različitim malignitetima, pa i hematološkim. Ispituju se potencijalno nove uloge već poznatih lekova i mogućnosti njihove šire primene i sinergističkog dejstva sa standardnom terapijom. Otkrivanje novih mehanizama ćelijske smrti i signalnih puteva koji su u taj proces uključeni dovodi do otkrivanja potencijalno nove ciljne terapije. Sve ovo iz ugla kliničara deluje vrlo interesantno i ohrabrujuće, ali su neophodne dalje kliničke studije i validacija rezultata dobijenih in vitro i na laboratorijskim životinjama.

 NAPOMENA: Osnove metabolizma gvožđa i feroptoze su ispitivane u okviru doktorske disertacije prvog autora, odbranjene 2022. godine.