Prognostički i prediktivni značaj merljive rezidualne bolesti u akutnoj mijeloblastnoj leukemiji

Uvod: Akutna mijeloblastna leukemija (AML) predstavlja heterogenu grupu klonskih neoplastičnih bolesti hematopoeznih ćelija. Određivanje rezidualnih leukemijskih ćelija (merljiva rezidualna bolest; engl. measurable residual disease – MRD) predstavlja najvažniji prognostički i prediktivni faktor u akutnoj mijeloblastnoj leukemiji.

Cilj rada: Cilj rada je analiza efekta primenjene hemioterapije na osnovu rezultata MRD testa kod bolesnika sa akutnom mijeloblastnom leukemijom, lečenih na Klinici za hematologiju Univerzitetskog kliničkog centra Srbije.

Materijali i metode: Naša studija je obuhvatila analizu 111 bolesnika sa akutnom mijeloblastnom leukemijom, lečenih u periodu od januara 2020. do januara 2024. godine. Sve dijagnostičke procedure su bazirane na najnovijim preporukama ELN (engl. European LeukemiaNet) grupe.

Rezultati: Značajno dužu remisiju (engl. complete remission – CR)i duže ukupno preživljavanje (engl. overall survival – OS) imali su bolesnici koji su posle MRD+ nastavili lečenje intenzivnom hemioterapijom (HT), primenom punih doza 3+7 hemioterapija, kao reindukcije. CR (p = 0,004) i OS (p = 0,019) su bili statistički značajno duži kod bolesnika koji su na kraju lečenja zadržali negativni MRD status. Kod transplantiranih bolesnika, ukupno preživljavanje (OS; p = 0,006) i trajanje remisije (CR; p = 0,002) bili su značajno duži (medijana: OS 20 meseci; CR 21 mesec), u odnosu na grupu netransplantiranih bolesnika (medijana: OS 13 meseci; CR 8 meseci).

Diskusija: Kao biomarker, merljiva rezidualna bolest (engl. measurable residual disease – MRD) može imati prognostički i prediktivni značaj, ali apsolutni merljivi nivo bolesti nije jedina determinanta ishoda bolesnika pošto biologija akutne mijeloblastne leukemije i drugi klinički faktori samog bolesnika (starost, komorbiditeti, različite komplikacije primenjene hemioterapije, naročito infektivne) modifikuju rizik povezan sa rezultatima MRD testa.

Zaključak: Studija je pokazala veliki značaj pravovremenog određivanja MRD, adekvatnost primene intenzivnije HT kod MRD pozitivnih bolesnika, uz nastavak lečenja alogenom transplantacijom matičnih ćelija hematopoeze.

UVOD

Akutna mijeloblastna leukemija (AML) predstavlja heterogenu grupu klonskih neoplastičnih bolesti hematopoeznih ćelija. Primena intenzivne hemioterapije, sa ili bez primene inhibitora malih molekula ili imunoterapije, dovodi do visokog procenta citomorfološke remisije od oko 80%, naročito kod bolesnika mlađih od 60 godina. Problem je visoka stopa relapsa, koja iznosi 30% – 60% unutar dve godine, što predstavlja glavnu barijeru dugotrajnom izlečenju u AML-u [1]. Odavno je poznato da citomorfološka remisija, koja ima nivo osetljivosti od oko 1%, odnosno prisutnost manje od 5% blasta, brojano na 300 do 500 ćelija sa jedrom, nije garancija potpunog izlečenja kada je u pitanju AML [1],[2].

Određivanje rezidualnih leukemijskih ćelija, prvobitno nazvano: minimalna rezidualna bolest (engl. minimal residual disease – MRD) a zatim merljiva rezidualna bolest, (engl. measurable residual disease – MRD), predstavlja najvažniji prognostički i prediktivni faktor u AML-u [3].

U poslednjih pet godina, meta-analize su pokazale da, bez obzira na korišćenu metodologiju određivanja MRD, bolesnici koji su bili pozitivni, bilo u određenom vremenskom trenutku pre alogene transplantacije matičnih ćelija hematopoeze (aloTMĆH) ili uopšteno, u bilo kom periodu lečenja akutne mijeloblastne leukemije, imaju značajno kraće preživljavanje u odnosu na MRD negativne bolesnike [4],[5].

Postoje tri glavne tehnike određivanja MRD u AML-u: multiparametarska protočna citometrija (engl. – multiparametric flow-cytometry – MFC), metoda kvantitativne lančane reakcije polimeraze (engl. – quantitative polymerase chain reaction – qPCR) i sekvencioniranje sledeće generacije (engl. – next-generation sequencing – NGS) [1],[4],[5].

Imunofenotipizacija pomoću MFC tehnike je ključna za postavljanje dijagnoze akutne mijeloblastne leukemije, ali i za određivanje MRD. Precizno primenjenim markerima postiže se osetljivost od 10^-3. Postoje dva pristupa u ovoj metodi. Prvi se bazira na identifikaciji jednog ili više imunofenotipova povezanih sa leukemijom (engl. – leukemia associated immunophenotype – LAIP) pri postavljanju dijagnoze i praćenju tokom celokupnog lečenja. Drugi se fokusira na detekciju ćelijske populacije koja pokazuje odstupanje od obrazaca ekspresije antigena karakterističnih za normalne ili regenerišuće ćelije, takozvane razlike od normalnog (engl. difference from normal – DfN). Preporučuje se kombinacija oba pristupa [6],[7].

Metoda lančane reakcije polimeraze (engl. polymerase chain reaction – PCR) ima senzitivnost od 10^-4 do 10^-5. Ovom metodom se mogu otkriti mutacije DNK na veoma osetljivim nivoima. Lančana reakcija polimeraze predstavlja osetljiviji i standardizovaniji način kvantifikacije specifične mutacije, što izgleda kao idealna metoda za detekciju niskog nivoa rezidualnih leukemijskih ćelija. Međutim, i ova metoda ima nekoliko ograničenja. Možda je najvažnije ograničenje heterogenost same akutne mijeloblastne leukemije, jer je, uprkos brojnim citogenetskim i molekularnim mutacijama, genom relativno stabilan u AML-u. Izuzetak su kasni stadijumi AML-a, kao i postojanje mutacije TP53 ili kompleksnog kariotipa [8],[9].

Sekvencioniranje sledeće generacije DNK i RNK je najosetljivija tehnika (do 10^-7 senzitivnosti), ali se standardi ove tehnike još uvek uspostavljaju. Glavno ograničenje ove tehnike, kada je u pitanju određivanje MRD, jeste činjenica da je AML „tornado“ niskog mutacionog statusa, gde često mutacije nisu u jednoj tački, već su u pitanju fuzije gena ili druge strukturne varijacije, koje je teže otkriti aktuelnim NGS pristupom. Takođe, još jedno ograničenje NGS-a je što se ne mogu detektovati varijante sa učestalošću manjom od 1%, zbog stope greške konvencionalnog NGS-a, dajući mogućnost lažno negativnog rezultata [10],[11],[12].

Posle 60 godina relativne stagnacije u osavremenjivanju kriterijuma odgovora u AML-u, Evropska mreža za leukemiju (engl. European LeukemiaNet – ELN) je, 2017. godine, uvela novu kategoriju MRD-negativnih kompletnih remisija [13]. Zatim je, 2018. godine, usledilo saopštenje prvog ELN konsenzusa o standardnim smernicama za lečenje, koji sadrži detaljna uputstva za primenu protočne citometrije, molekularnog testiranja i kliničkih tumačenja MRD u AML-u [14].

ELN AML MRD smernice su ažurirane (uz pretpostavku da će ove smernice zasnovane na dokazima biti ažurirane svake dve do četiri godine). One sadrže skoro 60 različitih preporuka koje obuhvataju niz metoda detekcije MRD, kao što je multiparametarska protočna citometrija (MFC) MRD, potom molekularni MRD, kao i smernice za kliničku upotrebu MRD i uputstva za budući napredak u sferi MRD [15].

CILJ RADA

Svesni velikog prognostičkog i prediktivnog značaja merljive rezidualne bolesti, analizirali smo njen značaj kod bolesnika sa AML-om lečenih na Klinici za hematologiju UKCS, sa ciljem da prikažemo strategiju testiranja MRD, vidove terapije koje smo primenjivali, posebno kod MRD pozitivnih (MRD⁺) bolesnika, i preživljavanje bolesnika sa AML-om u odnosu na vrednost MRD.

MATERIJALI I METODE

Dijagnoza je uspostavljena pomoću mijelograma. Određivanje imunofenotipskih karakteristika AML-a je zvršeno pri dijagnozi bolesti; urađeno je citogenetsko/ molekularno ispitivanje; stratifikacija rizika bolesnika sa AML-om je izvršena na osnovu ELN kriterijuma [16]. Za određivanje MRD statusa, korišćena je metoda multiparametarske protočne citometrije, na osmokolornom protočnom citometru [17],[18].

Statistička analiza

U zavisnosti od od tipa varijabli i normalnosti raspodele, deskripcija podataka je prikazana kao n (%) ili medijana (min-maks). Za analizu preživljavanja korišćena je Kaplan-Majerova metoda. Za procenu funkcije preživljavanja ovih pacijenata u zavisnosti od transplantacije i pozitivne MRD posle tri ili više ciklusa hemioterapije korišćen je log-rank test, a za procenu nezavisnog prediktora smrtnog ishoda primenjen je Koksov proporcionalni regresioni model sa 95% intervalom poverenja. Podaci su cenzorisani iz sledećih razloga: ispitanik je preživeo celokupan period praćenja ili je izgubljen iz evidencije. Statističke hipoteze su testirane na nivou statističke značajnosti (alfa nivo) od 0,05. Svi podaci su obrađeni u IBM SPSS Statistics 24 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) softverskom paketu ili u R programskom okruženju (R Core Team, 2023).

REZULTATI

Naša studija je obuhvatila analizu 111 bolesnika sa AML-om, lečenih na Klinici za hematologiju UKCS, u periodu od januara 2020. do januara 2024. Svi bolesnici su primili najmanje dva ili više ciklusa hemioterapije (HT). Procena MRD je rađena nakon dva ciklusa hemioterapije (indukcija i reindukcija ili indukcija i prva konsolidacija) i na kraju lečenja hemioterapijom. Medijana starosti ispitivanih bolesnika je bila 55 godina (18-75 godina). Od 111 bolesnika, 71 (64%) bolesnik je bio starosti 18-60 godina, dok je 40 (36%) bolesnika bilo starijeg životnog doba, iznad 60 godina. Od ukupnog broja, 64 (57,7%) bolesnika je bilo ženskog pola, dok je 47 (42,3%) pacijenata bilo muškog pola. Najveći broj bolesnika, ukupno 59 (53,2%), imalo je ECOG performans status (PS) 1. Neuroleukemiju je imalo 29 (26,1%) bolesnika. Prema ELN klasifikaciji, najviše bolesnika je svrstano u grupu intermedijarnog rizika, odnosno 67 (60,4%) bolesnika, povoljan oblik je imalo 20 (18,0%) pacijenata, dok je nepovoljan oblik bio prisutan kod 24 (21,6%) pacijenta. FLT3-ITD (engl. FMS-like tyrosine kinase 3 internal tandem duplication) pozitivnost je bila prisutna kod 15 (13,5%) pacijenata, dok je NPM1 (engl. nucleophosmin 1) mutacija bila pozitivna kod 27 (24,3%) bolesnika. Dati rezultati su prikazani u Tabeli 1.

Tabela 1. Inicijalne kliničke karakteristike ispitivanih bolesnika

Najčešći primenjivani protokol indukcione hemioterapije je bio 3+7 i primenjen je kod 61 (55%) bolesnika. Sedam (6,3%) pacijenata je uz 3+7 primilo i FLT3 (FMS-like tyrosine kinase 3) inhibitor (midostaurin), dok je 25 (22,5%) bolesnika primalo 3+7 light, odnosno 18 (16,2%) bolesnika je primilo 2+5 protokol.

Citomorfološku remisiju nakon indukcione HT postiglo je 64 (57,7%) bolesnika. Citomorfološka remisija nakon primene reindukcione HT je postignuta kod još 20 (18%) pacijenata, dok je preostalih 27 (24,3%) bolesnika bilo refraktorno na primenjenu HT. Dakle, u citomorfološkoj remisiji je, posle indukcije i reindukcije, bilo 84 (75,7%) bolesnika.

Nakon primene dva ciklusa HT, MRD negativnost je ostvarena kod 35 (31,5%) bolesnika i svi su u nastavku lečeni IDAC konsolidacionom terapijom. Pozitivnu vrednost MRD je imalo 76 (68,5%) bolesnika koji su lečeni različitim HT protokolima: Mitox-VP je primao 31 (40,8%) bolesnik, IDAC+DA je primilo 19 (25%) pacijenata, IDA-VP je dobilo 8 (10,5%) bolesnika, MEC je primilo 7 (9,2%) pacijenata, 3+7 je dobilo 7 (9,2%) bolesnika, IDAC su dobila tri (4,0%) bolesnika, dok je FLAG IDA primio jedan (1,3%) pacijent (Grafikon 1).

Grafikon 1. Vrsta primenjene terapije kod MRD pozitivnih bolesnika (nakon II ciklusa inicijalne terapije) Nakon primene dva ciklusa HT, MRD negativnost je ostvarena kod 35 (31,5%) bolesnika i svi su u nastavku lečeni konsolidacionom IDAC terapijom. Pozitivnu vrednost MRD-a je imalo 76 (68,5%) bolesnika, koji su lečeni različitim HT protokolima: Mitox-VP je primio 31 (40,8%) pacijent; IDAC+DA je primilo 19 (25%) pacijenata; IDA-VP je primilo 8 (10,5%) bolesnika; MEC je dobilo 7 (9,2%) pacijenata; 3+7 je primilo 7 (9,2%) bolesnika; IDAC je dobilo tri (4,0%) bolesnika; FLAG IDA je primio jedan (1,3%) pacijent.

Kod 81 (73%) pacijenta je rađen i MRD na kraju lečenja, od kojih je 46 imalo negativan MRD, dok je 35 bolesnika imalo pozitivan MRD. Takođe, od 50 bolesnika koji su imali MRD pozitivnost nakon drugog ciklusa HT, 28 (56%) pacijenata je ostvarilo negativan MRD na kraju lečenja. Relaps bolesti je ustanovljen kod 43 (37,8%) pacijenta.

Medijana ukupnog preživljavanja (engl. overall survival – OS) je kod naših bolesnika iznosila 13 meseci (2-69). Medijana dužine citomorfološke remisije je kod naših bolesnika iznosila 9 meseci (0-64). Medijana preživljavanja je kod mlađih bolesnika (18-60 godina) iznosila 18,0 meseci (95% CI = 13,3-22,7), dok je kod starijih (> 60 godina) pacijenata iznosila 13,0 meseci (95% CI = 7,5-18,5), što je statistički značajna razlika (log-rank = 3,722; p = 0,054). Dužina remisije (engl. complete remission – CR) je bila značajno veća u starosnoj grupi 18-60 godina u odnosu na grupu > 60 godina (p = 0,02, HR = 0,568, 95% CI = 0,352-0,915).

Nije postojala statistički značajna razlika u ukupnom preživljavanju (OS) i dužini remisije (CR) u odnosu na pol (p = 0,245, HR = 1,321, 95% CI = 0,826-2,114). Nije utvđena statistički značajna razlika u ukupnom preživljavanju (OS) i dužini CR u odnosu na MRD I status (posle prve konsolidacije ili nakon dva ciklusa uvodne terapije reindukcije), (p = 0,380; p = 0,288).

Međutim, medijana preživljavanja kod bolesnika sa pozitivnim MRD testom na kraju lečenja je iznosila 16,0 meseci (95% CI = 9,3-22,7), dok je kod MRD negativnih pacijenata iznosila 36,0 meseci (95% CI = 17,6-54,4), što je statistički značajna razlika (p = 0,019). Ispitanici sa pozitivnim MRD na kraju lečenja imali su više od dva puta veći hazard za nastanak smrtnog ishoda (HR = 2,06, 95% CI = 1,10-3,85; p = 0,024), (Grafikon 2). Takođe, dužina CR je bila statistički značajno veća kod bolesnika sa negativnim MRD na kraju lečenja (p = 0,004, HR = 2.517, 95% CI = 1,342-4,720).

Grafikon 2. Kaplan-Majerova kriva ukupnog preživljavanja (engl. overall survival – OS) u odnosu na MRD status na kraju lečenja Medijana preživljavanja kod bolesnika sa pozitivnim MRD-om na kraju lečenja iznosila je 16,0 meseci (95% CI = 9,3-22,7), dok je kod pacijenata sa negativnim MRD-om iznosila 36,0 meseci (95% CI = 17,6-54,4), što je statistički značajna razlika (p = 0,019). Ispitanici sa pozitivnim MRD-om na kraju lečenja imali su za preko dva puta veći hazard za nastanak smrtnog ishoda (HR = 2,06, 95% CI = 1,10-3,85; p = 0,024).

Ukupno preživljavanje (OS) je bilo značajno duže u grupi sa intermedijarnim rizikom leukemije (medijana 18 meseci) prema ELN klasifikaciji, u odnosu na grupu sa povoljnim (medijana 13 meseci) i nepovoljnim (medijana 6 meseci) rizikom (p = 0,013). Takođe, dužina trajanja remisije (CR) je bila značajno duža u grupi bolesnika sa intermedijarnim rizikom (medijana 14 meseci), u odnosu na povoljni (medijana 11 meseci) i nepovoljni rizik (medijana 5 meseci), (p = 0,014, HR = 0,503, 95% CI = 0,291-0,871).

Ukupno preživljavanje (OS) je bilo značajno duže kod bolesnika kod kojih je primenjena reindukcija punim dozama protokola 3+7 nakon pozitivnog MRD (medijana preživljavanja 35 meseci), dok je preživljavanje kod primene drugih protokola bilo značajno manje: IDAC (medijana 15,5 meseci), IDAC+DA (medijana 13 meseci), MEC (medijana 10 meseci), Mitox-VP (medijana 10 meseci), IDA-VP (medijana 7,5 meseci).

Transplantacija je izvršena kod 40 bolesnika (36%). Indikacije za transplantaciju su bile sledeće: nepovoljan rizik (ELN) kod šest (15%) pacijenata, relaps bolesti kod 12 (30%) pacijenata, pozitivan MRD kod 22 (55%) bolesnika. Medijana preživljavanja kod transplantiranih bolesnika je iznosila 20 meseci (95% CI = 4,0-36,0), dok je kod netransplantiranih pacijenata iznosila 13 meseci (95% CI = 10,1-15,9), što je statistički značajna razlika (p = 0,006). Ispitanici sa transplantacijom su imali za 50% manji hazard za nastanak smrtnog ishoda (HR = 0,498, 95% CI = 0,296-0,839; p = 0,009), (Grafikon 3). Trajanje remisije (CR) je bilo značajno duže (21 mesec) kod transplantiranih, u odnosu na grupu netransplantiranih bolesnika (8 meseci), (p = 0,002, HR = 0,441, 95% CI = 0,261-0,745).

Grafikon 3. Kaplan-Majerova kriva ukupnog preživljavanja (engl. overall survival – OS) kod bolesnika na hemioterapiji u odnosu na transplantirane pacijente Medijana preživljavanja kod transplantiranih bolesnika iznosila je 20 meseci (95% CI = 4,0-36,0), dok je kod netransplantiranih pacijenata iznosila 13 meseci (95% CI = 10,1-15,9), što je statistički značajna razlika (p = 0,006). Ispitanici sa transplantacijom su imali za 50% manji hazard za nastanak smrtnog ishoda (HR = 0,498, 95% CI = 0,296-0,839; p = 0,009).

DISKUSIJA

Kao biomarker, merljiva rezidualna bolest (MRD) može imati i prognostički, kao i prediktivni značaj, ali apsolutni merljivi nivo bolesti nije jedina determinanta ishoda bolesnika pošto biologija AML i drugi klinički faktori samog bolesnika (starost, komorbiditeti, različite komplikacije primenjene HT, naročito infektivne) modifikuju rizik povezan sa rezultatima MRD testa [19],[20],[21].

Jasno je da sve mutacije detektovane pri dijagnozi AML-a neće biti od jednake kliničke koristi za praćenje MRD. Optimalni ciljevi za molekularno merenje MRD takođe nisu definisani. Izolovana detekcija mutacija uobičajenih u klonskoj hematopoezi povezanoj sa starenjem (engl. age-related clonal hematopoiesis), npr. DNMT3A, TET2, ili ASKSL1, ili kod sindroma nasledne predispozicije (engl. germline predisposition syndromes), npr. DDKS41, RUNKS1 ili GATA2, nužno ne predstavljaju rezidualnu AML [17],[18],[19],[20].

U našoj studiji smo pokazali da nije bilo značajne razlike u dužini CR i u OS između bolesnika u odnosu na status MRD posle dva ciklusa HT. Sa druge strane, vrsta primenjene HT kod MRD+ bolesnika je imala značajnog uticaja na dužinu CR, kao i na OS, sa značajno dužom CR i dužim OS kod bolesnika koji su posle MRD+ nastavili lečenje punim dozama 3+7 HT, kao reindukcije. Takođe, CR i OS su bili statistički značajno duži kod bolesnika koji su na kraju lečenja zadržali negativan MRD status.

U odnosu na ELN stratifikaciju rizika, najduže OS su imali bolesnici intermedijarne grupe rizika. Jedno od mogućih objašnjenja je da su bolesnici iz povoljne grupe bolesnika, za koje se očekivalo da imaju najduže OS imali određene genske mutacije koje nismo detektovali usled toga što, za sada, testiranje na njih nije deo standardnog vida ispitivanja na našoj klinici.

Bolesnici lečeni alogenom TMĆH su imali statistički duže trajanje CR i OS, u odnosu na netransplantirane bolesnike, što je pokazano u nekoliko velikih studija [22],[23],[24].

ZAKLJUČAK

Analizom rezultata ove studije, kao i podataka iz literature, izvedeno je nekoliko zaključaka.

Postojeći podaci ukazuju na to da su mutacije u genima signalnog puta (FLT3, KIT, RAS, i dr.) korisne kada su pozitivne, ali njihova negativnost u kasnijem praćenju ne mora obavezno značiti molekularnu remisiju, posebno kada je mutacija terapeutski targetovana (ciljana) adekvatnim agensima. Takođe, pitanje je da li negativnost MRD ima isti prognostički značaj ako se postigne nakon intenzivne u odnosu na neintenzivnu terapiju.

Kao biomarker, merljiva rezidualna bolest (MRD) može imati i prognostički i prediktivni značaj, ali apsolutni merljivi nivo bolesti nije jedina determinanta ishoda bolesnika, pošto biologija AML-a i drugi klinički faktori modifikuju rizik povezan sa rezultatima MRD testa.

Naša studija je pokazala veliki značaj pravovremenog određivanja MRD, te adekvatnost primene intenzivnije HT kod MRD pozitivnih bolesnika, uz nastavak lečenja alogenom transplantacijom matičnih ćelija hematopoeze.