Ispitivanje In vitro osetljivosti Borrelia afzelii, uzročnika lajmske borelioze, na supernatante Lactiplantibacillus plantarum i Saccharomyces boulardii

Uvod: Lajmska borelioza (LB) je multisistemsko oboljenje koje uzrokuju bakterije iz kompleksa Borrelia burgdorferi sensu lato, a prenose je ubodom krpelji roda Ixodes. Terapija antibioticima zahteva dugotrajno lečenje, dok trenutno na tržištu ne postoji topikalni proizvod za profilaktičku primenu nakon uboda krpelja koji bi sprečio lokalnu infekciju i dalju diseminaciju patogena u sistemsku cirkulaciju.

Cilj rada: Cilj studije bio je da se in vitro ispita uticaj supernatanata probiotskih mikroorganizama Saccharomyces boulardii i Lactiplantibacillus plantarum i njihovih mešavina na rast i pokretljivost Borrelia afzelii.

Materijali i metode: Korišćen je soj B. afzelii, prethodno izolovan iz krpelja vrste Ixodes ricinus, koji je umnožen do koncentracije 1–2 x 10⁶ borelija/mL u Barbour-Stoenner-Kelly-H hranljivoj podlozi. Za ispitivanje osetljivosti testiranog soja na probiotske mikroorganizme korišćena je modifikovana bujon mikrodiluciona metoda za borelije. Minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) određene su posmatranjem broja i pokretljivosti borelija nakon 72 sata inkubacije pod anaerobnim uslovima u prisustvu supernatanata, a u poređenju sa pozitivnom kontrolom – netretiranom kulturom B. afzelii.

Rezultati: MIK je definisana kao najniža koncentracija testiranogsupernatanta pri kojoj borelije nisu bile pokretne a njihov broj je bio smanjen u odnosu na pozitivnu kontrolu. Definisane su sledeće MIK vrednosti: medijana 12,5% za S. boulardii i 6% za L. plantarum, dok je najniža MIK vrednost (medijana 0,8%) definisana za mešavinu supernatanta probiotskih mikroorganizama.

Zaključak: Supernatanti S. boulardii i L. plantarum pokazali su antimikrobno dejstvo na B. afzelii, dok je mešavina ovih supernatanata pokazala efektivniji inhibitorni efekat na rast i pokretljivost borelija. Dobijeni rezultati daju nam osnovu za dalja istraživanja molekularnih mehanizama inhibitornog dejstva probiotskih mikroorganizama na rast borelija.

UVOD

Lajmska borelioza (LB) je zoonoza čije uzročnike ubodom prenose inficirani krpelji roda Ixodes. Uzročnici LB su spiralne bakterije iz kompleksa Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.) [1],[2]. Primarni vektori u Evropi su krpelji vrste Ixodes ricinus [3]. Budući da LB predstavlja multisistemsko oboljenje ljudi i životinja, bolest se može ispoljiti različitim kliničkim manifestacijama kao što su: kožne lezije, mišićno-skeletne, neurološke, okularne i/ ili kardiovaskularne manifestacije, dok u nekim slučajevima, infekcija prolazi asimptomatski ili čak u kasnijim fazama LB može biti pogrešno dijagnostikovana zbog kompleksnosti kliničkih znakova i simptoma [2],[4].

Kompleks B. burgdorferi s.l. obuhvata do sada 21 imenovanu vrstu borelija. Dok je u Severnoj Americi glavni uzročnik LB vrsta Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.), u Evropi je prisutan veći diverzitet borelija sa pet potvrđenih patogenih vrsta: Borrelia afzelii, Borrelia garinii, B. burgdorferi s.s., Borrelia spielmanii i Borrelia bavariensis. Vrste Borrelia lusitaniae, Borrelia valaisiana i Borrelia bissettii su takođe izolovane ili detektovane kod ljudi, ali njihov patogeni potencijal nije u potpunosti razjašnjen [2].

Dok su u većini evropskih zemalja u krpeljima najzastupljenije vrste borelija B. afzelii, B. garinii i B. valaisiana [5], u Srbiji je najdominantnija vrsta B. lusitaniae, praćena vrstama B. afzelii, B. bavariensis, B. garinii, B. valaisiana i B. burgdorferi s.s. [6],[7]. Najčešća klinička manifestacija lajmske bolesti u Srbiji je erythema migrans, koja je zabeležena u 93,2% slučajeva, slede neurološke, mišićno-skeletne, i kardiološke manifestaticije, u 2,8%, 2,4%, odnosno 1,1% slučajeva [8].

Generalno, tok LB se može podeliti u tri kliničke faze. Prva faza – rana lokalizovana infekcija – najčešće se manifestuje kao kožna lezija erythema migrans, karakteristična crvena promena u obliku koncentričnog kruga na mestu uboda inficiranog krpelja koja se obično javlja sedam dana nakon infekcije. Ova lezija može biti praćena različitim simptomima uključujući groznicu, glavobolju, bolove u mišićima i zglobovima, kao i uvećanjem limfnih čvorova [1],[2],[9]. Druga faza – rana diseminovana infekcija – razvija se nekoliko nedelja do nekoliko meseci nakon uboda i ako se antibiotska terapija ne sprovede u prvoj fazi, borelije iz primarne kožne lezije mogu da diseminuju i tako zahvate nervni sistem, kožu, zglobove i srce. Treća faza – kasna diseminovana infekcija se javlja nekoliko meseci ili čak nekoliko godina nakon uboda inficiranog krpelja i može dovesti do teških neuroloških, reumatoloških i dermatoloških komplikacija [1],[2]. Iako sve patogene vrste borelija mogu izazvati erythema migrans i diseminovati u cirkulaciju, B. afzelii najčešće ostaje lokalizovana na koži i često se povezuje sa kožnim manifestacijama koje se javljaju u trećoj fazi poput acrodermatitis chronica atrophicans (ACA) prisutnih isključivo u Evropi dok se B. burgdorferi s.s. povezuje sa reumatološkim manifestacijama, posebno lajmskim artritisom, koji je učestaliji u Severnoj Americi nego u Evropi. Vrste Borrelia garinii i B. bavariensis najčešće uzrokuju neurološke simptome, lajmsku neuroboreliozu, koji se javljaju u drugoj i trećoj fazi lajmske borelioze [2].

Nakon postavljanja dijagnoze, trajanje i doza antibiotske terapije (oralna ili intravenska) određuju se u zavisnosti od faze bolesti, starosti pacijenta, i njegovog imunološkog statusa, a u terapiji se najčešće koriste doksiciklin, amoksiciklin, ceftriakson, cefuroksim, i azitromicin, u vremenskom periodu od 10 do 30 dana u zavisnosti od oblika i faze bolesti [1]. Najbolja zaštita od LB jeste izbegavanje uboda krpelja i detaljan pregled kože nakon boravka u prirodi. Preventivna upotreba antibiotika nakon uboda krpelja se ne preporučuje iz razloga što nije svaki krpelj inficiran borelijama i neće svaki inficirani krpelj da prenese patogen nakon uboda. U Evropi ne postoje vodiči i/ili smernice za takvu namenu. Takođe, na tržištu do sada nije plasiran topikalni proizvod koji bi se primenjivao na koži nakon uboda krpelja i tako sprečio transfer borelija u kožu. Ne postoji ni preparat koji bi se koristio za lokalni tretman erythema migrans u cilju sprečavanja dalje diseminacije borelija u sistemsku cirkulaciju. Za razliku od patogenih vrsta borelija, koje mogu izazvati lokalne i sistemske manifestacije LB i zahtevaju antibiotsku terapiju, probiotski mikroorganizmi su pokazali pozitivne efekte na zdravlje ljudi [10],[11]. Određeni sojevi proizvode antimikrobne supstance, poput organskih kiselina, bakteriocina, peptida i polisaharida, koje se tokom kultivacije oslobađaju u supernatante [12]. Probiotski kvasac Saccharomyces boulardii za sada nepoznatim mehanizmima, in vitro inhibira rast nekih patogenih i uslovno patogenih mikroorganizama poput Candida albicans, Escherichia coli, Salmonella enterica serovar Typhi, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Salmonella enteritidis [12],[13]. Takođe, određene vrste bakterija mlečne kiseline među kojima je Lactiplantibacillus plantarum, sprečavaju kolonizaciju patogena kompeticijom za hranljive materije i adhezivna mesta, modifikacijom uslova sredine koja postaje nepovoljna za rast patogena, proizvodnjom antimikrobnih jedinjenja i modulacijom imunskog odgovora [14],[15].

Transformacija bakterija tokom vremena i velika i/ ili povećana potrošnja antibiotika širom sveta značajno doprinose porastu antimikrobne rezistencije, što predstavlja ozbiljnu pretnju po javno zdravlje na globalnom nivou. Samo tokom 2019. godine, antimikrobna rezistencija je bila odgovorna za smrt najmanje 1,27 miliona ljudi širom sveta, što jasno pokazuje da predstavlja ozbiljan rizik za zdravlje ljudi u svim životnim dobima [16]. Zbog ograničenja u lečenju lajmske borelioze, neophodno je razviti bezbedne i delotvorne alternativne pristupe, kao što je topikalni preparat na bazi biološki aktivnih komponenti, koji bi se profilaktički primenjivao nakon uboda krpelja ili na mestu primarne kožne lezije, s ciljem da spreči dalju diseminaciju borelija i time značajno smanji ili eliminiše potrebu za primenom antibiotika.

Cilj ove studije bio je da se in vitro ispita rast, razmnožavanje i pokretljivost B. afzelii u prisustvu supernatanata S. boulardii, L. plantarum i njihovih mešavina kao i da se odrede vrednosti njihovih minimalnih inhibitornih koncentracija (MIK).

MATERIJAL I METODE

U studiji je testiran soj B. afzelii RS163_11i, prethodno izolovan iz krpelja vrste I. ricinus [6], a koji je deo kolekcije izolata Instituta za medicinska istraživanja, Instituta od nacionalnog značaja za Republiku Srbiju, Univerziteta u Beogradu. Soj je čuvan na -80 °C u brucela-glicerol bujonu, rekultivisan u Barbour-Stoenner-Kelly-H (BSK-H) (HiMedia, India) podlozi i inkubiran na 33 °C do postizanja koncentracije borelija od 1–2 x 10⁶ /mL, dok je za određivanje broja borelija/mL primenjena Neubauer komora za brojanje (Brand Gmbh & Co. KG, Wertheim, Germany) u kombinaciji sa mikroskopiranjem u tamnom polju [17].

Za pripremu supernatanata korišćene su liofilizovane kulture iz komercijalno dostupnog probiotskog preparata, iz kojih su zatim izolovane čiste kulture S. boulardii i L. plantarum pripremljene na Katedri za mikrobiologiju i imunologiju, Farmaceutskog fakulteta Univerziteta u Beogradu.

Serije dvostrukih razblaženja supernatanta S. boulardii, L. plantarum i njihovih mešavina su pripremljene u BSK-H podlozi. Zapremina svakog testiranog supernatanta i njihove mešavine iznosila je 100 µL (početna maksimalna koncentracija 100%) koja je u opadajućim koncentracijama mešana sa 100 µL kulture ispitivanog soja B. afzelii, koncentracije 1–2 x 10⁶ borelija/mL, a samostalno služila kao pozitivna kontrola, dok je kao negativna kontrola korišćena BSK-H podloga. Od svakog testiranog probiotskog mikroorganizma (S. boulardii, L. plantarum i njihove mešavine), pripremljeno je po 10 serijskih dvostrukih razblaženja u opadajućim koncentracijama (od 100% do 0,2%), dok je mešavina supernatanata pripremljena u odnosu 1:1, dodavanjem po 50 µL svakog supernatanta u opadajućim koncentracijama počevši od maksimalne koncentracije, od 100% svakog probiotskog mikroorganizma.

Antibiotik ceftriakson je korišćen kao kontrolni antibiotik u bujon mikrodilucionoj metodi za borelije i testiran u rasponu 8–0,016 μg/mL kao što je prethodno opisano [18].

Antimikrobna aktivnost supernatanata i kontrolnog antibiotika ceftriaksona je ispitivana primenom modifikovane bujon mikrodilucione metode za borelije, s obzirom na to da Evropski komitet za ispitivanje antimikrobne osetljivosti (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing – EUCAST) i Institut za kliničke i laboratorijske standarde (Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI) ne definišu uputstva i kriterijume za izvođenje ove metode za borelije, kao ni granične vrednosti MIK za antibiotke [17]. Ukratko, za bujon mikrodilucionu metodu i određivanje MIK vrednosti antibiotika i testiranih supernatanata korišćene su sterilne plastične 96-mikrotitarske ploče. Prva kolona je služila kao pozitivna kontrola (kultura borelija), druga kolona kao negativna kontrola (BSK-H podloga), a od treće do 12. kolone bazeni su punjeni mešavinom borelija i testiranim supstancama u opadajućim koncentracijama [17]. Opseg testiranih koncentracija supernatanata probiotskih mikroorganizama u mikrotitarskim pločama je bio od 50% do 0,1%, za mešavinu probiotskih mikroorganizama od 25% do 0,05%, dok je za kontrolni antibiotik opseg bio od 168 μg/mL do 0,3 μg /mL [17]. Eksperimenti sa testiranim supstancama ponovljeni su dva puta u triplikatu. Nakon postavljanja mikrodilucionog testa, mikrotitarske ploče su inkubirane 72 sata na 33 °C u Gas-Pak posudi (BD GasPak™ EZ Container Systems) sa anaerobnim generatorom i indikatorom. Nakon inkubacije, određene su MIK vrednosti. Preparati su posmatrani mikroskopiranjem u tamnom polju i poređeni su broj i pokreljivost borelija u prisustvu testiranih supernatanata sa pozitivnom kontrolom i kontrolnim antibiotikom. MIK je definisana kao najniža koncentracija testiranog supernatanta probiotskog mikroorganizma (S. boulardii i L. plantarum, ili njihove mešavine) i antibiotika u kokultivaciji sa B. afzelii, pri kojoj borelije nisu bile pokretne ili su bile slabo pokretne, a njihov broj je bio smanjen u odnosu na pozitvnu kontrolu.

STATISTIČKA ANALIZA

Za statističku obradu podataka korišćeni su neparametarski Kruskal-Wallis test i Mann-Whitney test, a podaci su prikazani kao medijana (min-max). Statističke hipoteze su testirane na nivou statističke značajnosti p = 0,05.

Rezultati su prikazani tabelarno. Svi podaci su obrađeni u R programskom okruženju (R Core Team, 2024).

REZULTATI

Nakon 72 sata inkubacije na 33 °C određene su vrednosti MIK za S. boulardii, L. plantarum, njihovu mešavinu kao i za kontrolni antibiotik ceftriakson. Kruskal-Wallis test je pokazao da postoji statistički značajna razlika između MIK vrednosti testiranih supernatanata (S. boulardii, L. plantarum i njihovih mešavina) (p = 0,01). Mann-Whitney test je pokazao da postoji statistički značajna razlika između MIK vrednosti supernatanta S. boulardii i mešavine supernatanata (p = 0,02) kao i između supernatanta L. plantarum i mešavine supernatanata (p = 0,01) dok statistički značajna razlika ne postoji između supernatanata S. boulardii i L. plantarum (p = 0,68). Statističkom analizom je pokazano da mešavina testiranih probiotskih supernatanata efikasnije inhibira rast i razmnožavanje B. afzelii u odnosu na pojedinične probiotske supernatante.

Najefikasniji supernatant u inhibiciji rasta, razmnožavanja i pokretljivosti B. afzelii bila je mešavina supernatanata probiotskih mikroorganizama pri MIK vrednosti medijane od 0,8%. Rezultati su predstavljeni u Tabeli 1.

Tabela 1. Raspon i medijana vrednosti minimalnih inhibitornih koncentracija (MIK) (%) supernatanta Saccharomyces boulardii, Lactiplantibacillus plantarum i njihovih mešavina na vrstu Borrelia afzelii

Pored definisanih MIK vrednosti za supernatante S. boulardii, L. plantarum i njihovu mešavinu, pri nižim koncentracijama supernatanata probiotskih mikroorganizama uočena je povećana pokretljivost i broj borelija u odnosu na pozitivnu kontrolu. Prisustvo supernatanta S. boulardii, L. plantarum i njihovih mešavina, uticalo je stimulativno na broj i pokretljivost borelija u odnosu na pozitivnu kontrolu dok je B. afzelii bila najpokretljivija a njena brojnost najviše povećana u odnosu na pozitivnu kontrolu u prisustvu mešavine supernatanata pri vrednosti medijane od 0,1%. Rezultati su predstavljeni u Tabeli 2.

Tabela 2. Koncentracije (%) i vrednosti medijana (%) supernatanata Saccharomyces boulardii, Lactiplantibacillus plantarum i njihovih mešavina koje su stimulativno delovale na rast i pokretljivost vrste Borrelia afzelii

MIK vrednost za testirani kontrolni antibiotik na B. afzelli iznosio je 0,016 μg/mL (odnosno 0,3 μg/mL u mikrotitarskim pločama) što je u skladu sa prethodno objavljenim rezultatima i njegovom dokazanom inhibitirnom dejstvu na rast i razmnožavanje borelija.

DISKUSIJA

Saccharomyces boulardii je jedini eukariotski mikroorganizam koji se koristi u farmaceutskoj industriji u svrhu probiotika. Za sada su poznata dva mehanizma pomoću kojih S. boulardii deluje na patogene: vezivanjem za bakterije i njihove toksine, čime se olakšava njihova eliminacija i lučenje specifičnih proteina koji imaju ulogu u degradaciji toksina i/ili ćelijskih elemenata patogena [19]. Studija Rajkowske i Kunicka-Styczyńske [20] pokazala je da S. boulardii vezuje enteropatogene bakterije (E. coli, S. enterica var. Typhimurium, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni i Enterococcus faecalis) olakšavajući njihovu eliminaciju iz organizma. Uočeno je da S. boulardii značajno smanjuje broj ćelija Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa i S. aureus, a pored toga smanjuje i stopu rasta L. monocytogenes i P. aeruginosa.

Jedan od mehanizama kako L. plantarum kao i ostale bakterije mlečne kiseline utiču na patogene jeste proizvodnja različitih antimikrobnih jedinjenja, kao što su bakteriocin, vodonik peroksid, organske kiseline, aceton i masne kiseline [21],[22]. Antimikrobni peptidi-bakteriocini, deluju baktericidno ili inhibiraju rast srodnih bakterija, uključujući patogene sojeve. Poseduju niz pozitivnih svojstаva, a neka od njih su dejstvo protiv patogena rezistentnih na antibiotike, uz odsustvo ili nisku toksičnost prema eukariotskim ćelijama [23]. Na primer, plantaricin PLNC8 αβ-bakteriocin, koji proizvodi L. plantarum je pokazao antimikrobno dejstvo prema paradontalnom patogenu Porphyromonas gingivalis izazivanjem deformacije spoljašnje membrane i lize ćelija.

Upravo zbog pomenutog antimikrobnog dejstva oba probiotska mikroorganizma, polazna hipoteza je podrazumevala mogućnost postojanja antibakterijskog efekta, a glavni cilj studije je bio ispitati njihov inhibitorni efekat na uzročnika LB, bakteriju B. afzelii, in vitro, koji do sada nije ispitivan. Poređenje naših rezultata, sa rezultatima prethodnih istraživanja nije u potpunosti adekvatno, jer je korišćena drugačija metodologija sa različitim test mikroorganizmima. Takođe, u okviru naše studije dobijeni su prvi preliminarni rezultati za borelije primenom bujon mikrodilucione metode, kojom do sada nisu bili testirani pomenuti probiotski mikroorganizmi. U studiji iz 2012. godine je metodom difuzije u agaru testiran antimikrobni potencijal supernatanta S. boulardii protiv S. aureus, E. coli, C. albicans i Aspergillus niger [12]. Njihovi rezultati su prikazani kao zone inhibicije (u milimetrima), što nije direktno uporedivo sa rezultatima dobijenim u našoj studiji, s obzirom na razlike u primenjenoj metodologiji, korišćenim test organizmima i rezultatima koji su u našem slučaju predstavljeni procentima. Antimikrobna aktivnost supernatanta L. plantarum potvrđena je metodom tačkaste difuzije u agaru protiv sojeva E. coli, L. monocytogenes, E. faecalis i P. aeruginosa, pri čemu je veličina zone inhibicije korišćena kao pokazatelj intenziteta antimikrobnog delovanja [24]. U eksperimentu u kojem je primenjena bujonmikrodiluciona metoda [23], kao i u našoj studiji, korišćena je serija dvostrukih razblaženja različitih tipova plantaricina koji su bili predmet testiranja. Za razliku od navedenog rada, u našem ispitivanju korišćeni su celokupni supernatanti probiotskih mikroorganizama i B. afzelii iz kompleksa B. burgdorferi s.l., pri čemu je primenjena modifikovana mikrodiluciona metoda. S druge strane, bujon mikrodiluciona metoda za borelije nije standardizovana, tj. EUCAST i CLSI kao što je prethodno pomenuto, ne definišu smernice za izvođenje bujon mikrodilucione metoda za borelije, čak ni za ispitivanje osetljivosti borelija na antibiotike. S tim u vezi treba pomenuti da se ne definišu ni granične vrednosti MIK za antibiotike kada su u pitanju bakterije iz kompleksa B. burgdorferi s.l. Pored MIK koje smo utvrdili za ispitivane probiotske mikroorganizme, važan deo rezultata čine i podaci o procentualnim vrednostima koje su pokazale stimulativan uticaj na brojnost i pokretljivost borelija. Ovi nalazi predstavljaju prvi korak u razumevanju kako određeni probiotski sojevi mogu uticati na rast i ponašanje borelija u veštačkim uslovima. Time se otvara mogućnost daljeg usavršavanja BSK-H (Hi-Media) podloge – standardnog medijuma za njihovu kultivaciju, s ciljem da se ona učini efikasnijom za izolaciju i kultivaciju borelija iz različitih bioloških uzoraka. Iako je Sigma BSK-H podloga skupa, Hi-Media, koja ima isti sastav, predstavlja jeftiniju alternativu koja može značajno smanjiti troškove ispitivanja. Efikasnost podloge je ključna, jer uspešnost izolacije i kultivacije borelija zavisi upravo od njenog kvaliteta. U ovom kontekstu, prethodna istraživanja, poput studije Ružić-Sabljić i saradnika [25], pokazala je da Hi-Media podloga bolje stimuliše rast borelija. Naša istraživanja su dodatno potvrdila ove nalaze, pokazujući da dodavanje supernatanata probiotika borelijama utiče na njihov bolji rast i povećanu pokretljivost, čime se otvara nova perspektiva za primenu probiotika u optimizaciji laboratorijskih uslova za njihov rast. S druge strane, dobijene MIK vrednosti za supernatante S. boulardii i L. plantarum i njihovu mešavinu na B. afzelii (Tabela 1), predstavlja prvi do sada dobijen rezultat na borelijama sa ovim supernatantima, što pruža osnov za dalja istraživanja supernatanata i njihovog inhibitornog efekta na rast, razmnožavanje i pokretljivost borelija.

Ako se uzmu u obzir mogući značaj dobijenih MIK rezultata probiotskih mikroorganizama i potencijalne smernice daljeg istraživanja, treba razmotriti dalje aspekte istraživanja – formulaciju topikalnog (profilaktičkog) preparta, koji bi se primenjivao nakon uboda krpelja i čime bi se sprečila oralna i/ili intravenska primena antibiotika. Trenutno lek za LB koji bi se koristio topikalno ili profilaktički ne postoji. Ipak, 2017. godine je sprovedena pilot klinička studija u kojoj su ispitanici, nakon uboda krpelja topikalno nanosili preparat 10% azitromicina u formi gela [26]. Rezultati ove studije nisu bili zadovoljavajući za preporuku azitromicin-gela u profilaktičke svrhe. Još jedna studija bavila se sličnom tematikom. Naime, postoje dokazi o efikasnosti topikalne primene kreme azitromicina u cilju prevencije nastanka LB. Ipak, efikasnost u pružanju 100% zaštite od infekcije nakon uboda krpelja je za sada ispitivana samo na miševima [27].

Sve ovo ukazuje na potrebu za razvojem topikalnog preparata sa drugačijom formulacijom i mehanizmom delovanja. S tim u vezi ideja o mogućnosti zamene antibiotika prirodnim proizvodima, koji ne izazivaju neželjene efekte i uzrokuju manji rizik od daljeg razvoja antimikrobne rezistencije, i ujedino doprinose smanjenju ili racionalizaciji njihove upotrebe, postaje sve relevantnija. Formulacija potencijalnog topikalnog probiotskog preparata, na bazi testiranih probiotskih mikroorganizama, mogla bi značajno doprineti prevenciji erythema migrans, kao i mogućem sprečavanju širenja borelija sistemskom cirkulacijom. U našem istraživanju, pokazano je da se pri određenim koncentracijama supernatanta probiotskih mikroorganizama brojnost i pokretljivost borelija smanjuje, ali bez ispitanih molekularnih mehanizama delovanja. Zbog toga bi u daljim istraživanjima trebalo proučavati komponente supernatanata kao i molekularne mehanizme kojima supernatanti (celi) i/ili njihove komponente inhibiraju rast i pokretljivost uzročnika LB – B. afzelii. Upravo iz tog razloga se dalja istraživanja u svrhu formulacije topikalnog preventivnog probiotskog preparata na bazi ispitivanih probiotskih mikroorganizama ostavljaju kao otvoreno polje za buduća istraživanja.

ZAKLJUČAK

Ovim istraživanjem je pokazano da supernatanti S. boulardii i L. plantarum imaju antimikrobno dejstvo na B. afzelii. Kombinacija supernatanata ova dva probiotska mikroorganizma imala je najefikasnije dejstvo pri njihovoj mešavini (MIK vrednost medijana 0,8%), što ih čini potencijalnim kandidatima za dalje istraživanje. Takođe, primećena je stimulacija rasta i veća pokretljivosti borelija pri nižim koncentracijama supernatanata, odnosno njihovoj mešavini, pri koncentraciji vrednosti medijane 0,1%, što takođe zahteva dodatna ispitivanja. Potencijalni smerovi daljih istraživanja uključuju analizu sastava supernatanata i proučavanje molekularnih mehanizama kojima bi se objasnila inhibicija rasta, razmnožavanja i pokretljivosti B. afzelii. To bi dalje iniciralo pre svega istraživanja za razvoj topikalnog profilaktičkog preparata koji bi se primenjivao nakon uboda krpelja i koji bi sprečavao pojavu erythema migranas. Samim tim bi se mogla smanjiti diseminacija borelija u sistemsku cirkulaciju, rizik od kompikacija koje sa sobom nosi LB, kao i upotreba antibiotika.